(1)切片后固定，固定時間為30s-1min，清水稍沖洗1-2s。

(2)玻片浸沒于含蘇木素的染缸中，時間大概為3-5min;然后清水洗去蘇木素，大概5-10s。

(3)再把玻片浸沒于1%鹽酸乙醇2s;然后清水沖洗1-2s。這個時候在顯微鏡下觀察，細胞核呈紫藍色，細胞漿無色說明操作無誤。

(4)促藍液(可以是自來水，或者是1%氨水)返藍5-10s;清水稍沖洗1-2s，顯微鏡下觀察，細胞核藍色說明操作無誤。

(5)再把玻片浸沒于含伊紅的染色缸中30-60s，然后清水沖洗干凈表面。顯微鏡下觀察，細胞核藍色，細胞漿為紅色說明操作無誤。

(6)染色完的片子需要做透明處理來延長保存時間。利用不同濃度的酒精(從低濃度-高濃度)和二甲苯進行該項操作。顯微鏡下觀察，細胞核藍色，胞質(zhì):肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈現(xiàn)出深淺不一的紅色。

(7)中性樹膠封片，染色完成。

注意事項:

1.染色時調(diào)節(jié)pH值很重要。若組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2.切片染蘇木精后，分色是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚(晰)而細胞質(zhì)基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。

3.切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

4.在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

5.切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

6.最后封固時，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。

7.避免切片污染。出現(xiàn)切片污染，污染物遮蓋該部位的細胞或組織難以觀察期形態(tài)改變。應定期過濾各種染液和試劑以避免其中的沉淀物所引起的污染。

8.冬季室溫低時(14℃C以下)，二甲苯應在水浴缸中適當加溫到30℃C后再脫蠟，以避免因脫蠟不完全引起的染色不均勻呈霧化狀態(tài)。

9.徹底脫水與透明。切片經(jīng)酒精脫水后，過二甲苯時若為白色不透明狀態(tài)，為脫水不徹底，應將切片用酒精、二甲苯重新脫水與透明。

10.保持切片的濕潤。在染色過程中不要讓切片干燥,以免組織收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

11.封片注意事項。封片時要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，樹脂封固時不能有氣泡。

文章出自：組織冰凍切片染色實驗    想了解更多請關注：http://bjzjay.cn/