1.固定

灌流后的新鮮腦組織放入4%的多聚甲醛固定液(PFA)中，4度固定24小時(shí)

2.脫水

2.1使用1xPBS配制5%(m/v)和 30%(m/v)的蔗糖溶液。

2.2將 PFA換成5%(m/v)的蔗糖溶液，4 度脫水1小時(shí)

2.3 將 5%的蔗糖溶液換成 30%的蔗糖溶液，4度脫水 1-2 天，直至組織下沉。

3.OCT 包埋

3.1準(zhǔn)備適量干冰和包埋盒，并在包埋盒底部加入一層opti-mum cuttingtemperaturecompound (O.c.T.Compound)O

3.2將脫水完全的腦組織取出，使用 OCT 進(jìn)行潤洗。

3.3用鑷子夾取潤洗后的組織，將要切片的一面平放在包埋盒中，加入OCT直至淹沒組織，擠出OCT需用力均勻，避免產(chǎn)生氣泡。

3.4 將含有組織的包埋盒放在干冰上，待組織慢慢冷凍。

4.存儲(chǔ)

4.1若第二天直接進(jìn)行冰凍切片，包埋好的組織應(yīng)放在-80度冰箱過夜，以使組織在 OCT中凍的更完整。

4.2 若短期內(nèi)不進(jìn)行冰凍切片，包埋好的組織應(yīng)放在液中保存，

5.切片

5.1第二天從-80度冰箱中取出包埋盒，將包埋盒放在冰上，使其溫度平衡至-20 度左右。

5.2 解鎖 Leica 切片機(jī)，將切片機(jī)溫度和箱體溫度設(shè)置為-20 度。

5.3 從包埋盒的底部將包埋塊推出，使用OCT將包埋塊固定在切片機(jī)的樣品托上，然后將樣品放置在冷臺(tái)上進(jìn)行冷凍，通過旋鈕將樣品托固定在切片機(jī)上，準(zhǔn)備切片。

5.4通過切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)按鈕來設(shè)定切片的厚度，常規(guī)冰凍切片一般厚度為8-12 微米若進(jìn)行漂染 3D 重構(gòu)等實(shí)驗(yàn)，則需要切40 微米。

5.5通過切片機(jī)的快進(jìn)快退按鈕來調(diào)節(jié)刀片和組織包埋塊的距離，先進(jìn)行修片，待切片能夠完整地包含整個(gè)組織后，進(jìn)行手動(dòng)切片，并小心將切片貼在載玻片上，避免褶皺或破損。

5.6切片完成后，使用OCT將露出的組織重新包埋上，待慢慢冷凍好后，置于液中保存。

5.7 清理切片機(jī)和工作區(qū)域，將冰凍切片放在室溫1小時(shí)，使組織在載玻片上貼的更牢固，之后冰凍切片可直接用于染色或存放在-80 度冰箱。

文章出自：OCT包埋和冰凍切片      想了解更多請(qǐng)關(guān)注：http://bjzjay.cn/