1、概念：

熒光原位雜交（Fluorescence in situ Hybridization，簡(jiǎn)稱FISH）是一種基于核酸雜交原理的分子生物學(xué)技術(shù)，主要用于在細(xì)胞或組織中定位和檢測(cè)特定的DNA或RNA序列。它使用熒光標(biāo)記的探針，這些探針是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸片段，通過(guò)雜交反應(yīng)與目標(biāo)序列結(jié)合，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察和定位。

2、  實(shí)驗(yàn)設(shè)備：FISH實(shí)驗(yàn)需要的設(shè)備包括顯微鏡（最好是熒光顯微鏡）、恒溫水浴或雜交爐（用于探針的雜交）、離心機(jī)（用于樣品的處理和洗滌）、冷凍切片機(jī)（如果處理組織樣品）等。此外，還需要各種實(shí)驗(yàn)耗材，如滑片、蓋片、熒光標(biāo)記的探針等。

3、實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備：首先，需要將細(xì)胞或組織樣品制備到滑片上，并進(jìn)行固定。如果是細(xì)胞樣品，通?？梢灾苯油磕ǖ交希蝗绻墙M織樣品，可能需要進(jìn)行切片。固定的目的是保持細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)，并防止DNA或RNA的降解。

 DNA或RNA的變性：然后，需要通過(guò)加熱或使用化學(xué)試劑將樣品中的DNA或RNA變性，使其從雙鏈狀態(tài)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)，以便探針可以與其雜交。

探針雜交：接下來(lái)，將熒光標(biāo)記的探針加入到樣品中，讓它與目標(biāo)DNA或RNA序列進(jìn)行雜交。這通常在恒溫條件下進(jìn)行，需要一定的時(shí)間。

 洗滌：雜交后，需要通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的探針。

熒光顯微鏡觀察和圖像分析：最后，使用熒光顯微鏡觀察樣品，檢測(cè)和定位熒光信號(hào)。然后進(jìn)行圖像分析，根據(jù)熒光信號(hào)的位置和強(qiáng)度，得出目標(biāo)DNA或RNA序列在細(xì)胞或組織中的分布和表達(dá)水平。

4、  常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法：

 非特異性結(jié)合：如果探針與非目標(biāo)序列發(fā)生結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。這可以通過(guò)優(yōu)化雜交條件（如溫度、時(shí)間、探針濃度等）和使用更特異性的探針來(lái)減少。

信號(hào)強(qiáng)度低：信號(hào)強(qiáng)度低可能導(dǎo)致目標(biāo)序列的檢測(cè)不準(zhǔn)確。這可能是因?yàn)樘结樀馁|(zhì)量不好、探針的濃度不足、雜交條件不理想等原因。可以通過(guò)提高探針的質(zhì)量和濃度、優(yōu)化雜交條件、使用信號(hào)放大技術(shù)等方法來(lái)提高信號(hào)強(qiáng)度。

背景高：背景高可能使得真正的信號(hào)難以區(qū)分。這可能是由于非特異性結(jié)合、滑片的污染、熒光顯微鏡的設(shè)置不當(dāng)?shù)仍??？梢酝ㄟ^(guò)減少非特異性結(jié)合、提高滑片的清潔度、優(yōu)化顯微鏡的設(shè)置等方法來(lái)降低背景。

文章出自：熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)（FISH）    想了解更多請(qǐng)關(guān)注：http://bjzjay.cn/