關鍵詞：原位雜交

原位雜交（in situ hybridization）用特定標記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細胞中待檢測核酸按堿基互補配對的原則在原位進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的監(jiān)測系統(tǒng)，通過免疫組織化學方法在被檢測核酸原位進行細胞內核酸定位。原位雜交可根據(jù)檢測物而分為細胞內和組織切片原位雜交；根據(jù)其用探針及檢測核酸的不同可分為DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA雜交。根據(jù)標記方法不同可分為放射性探針和非放射性探針。

其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。

(一)取材與標本固定

1． 取材 對于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要快一些，取材后要盡快固定或冷凍保存運輸。

2． 固定 進行原位雜交的組織或細胞必須經(jīng)過固定處理，固定的目的是為了①保持細胞形態(tài)原有結構；②最大限度保存細胞內的DNA或RNA的水平；③使探針易于進入細胞或組織內。

3． 固定液 常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點因此要根據(jù)具體的實驗對象，選擇最適合的固定液。

4． 固定方法 組織標本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要時，動物組織可進行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過夜，次日可以進行冰凍切片。

(二)切片及細胞標本的制備

1． 載玻片的處理 因為原位雜交一般在載玻片上進行，所以載玻片必須保持清潔且不能有任何核酸酶的污染。一般載玻片可先經(jīng)洗衣粉浸泡過夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可經(jīng)15磅高壓滅菌20分鐘處理，可將載玻片上的核酸酶去除。

2． 組織切片和預處理

（1）冰凍切片：新鮮組織也可在取材后，直接置入液氮中迅速驟冷，冷凍切片后，4％多聚甲醛固定5～10分鐘，也可保存在-70℃中待用。雜交前切片迅速恢復至室溫并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10分鐘，滴加預雜交液室溫孵育1小時。

（2）石蠟切片：組織固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，可長期保存，隨時用于原位雜交。雜交前切片經(jīng)①二甲苯脫蠟2次，每次10分鐘；②純酒精洗2次，每次5分鐘；③空氣干燥5分鐘；④梯度酒精復洗95％，80％，70％各1分鐘；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5分鐘；⑥2×SSC洗10分鐘；⑦滴加預雜交液于濕盒內室溫孵育1小時。

（3）培養(yǎng)細胞：每張載玻片滴加200μl濃度為1×105/m1的細胞懸浮液，空氣干燥1～2分鐘制成細胞涂片，也可直接用培養(yǎng)細胞蓋片。上述細胞片經(jīng)酒精或多聚甲醛固定5分鐘，其余步驟和冰凍切片一樣。

(三)試劑配制

配制溶液過程中需要戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經(jīng)160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。

1． DEPC水 將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過夜，15~20分鐘高壓消毒，之后室溫避塵存放。

2． 0.1mol PBS pH 7.4

A液：0.1mol NaH2PO4為NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。

B液：0.1mol Na2HP04為Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。

A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其濃度達0.85％。

3． 20×SSC 為NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。

4． 4％多聚甲醛(pH 7.4) 為多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。

5． 緩沖液

（1） 緩沖液Ⅰ(pH 7.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。

（2） 緩沖液Ⅱ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。

（3） 緩沖液 Ⅲ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。

6． 去離子甲酰胺 將陰陽離子交換樹脂各5g加入50ml甲酰胺中，待樹脂下沉后用上清液。

7． 50％硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不斷攪動直至完全溶解。

8． 50×Denhardt's液 為1％Fico11type 400（聚蔗糖） 0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。

9． 預雜交液 為去離子甲酰胺5.0m1；20×SSC 2.0m1；鮭魚精DNA (10mg/m1) ；0.5ml（沸水變性10分鐘）；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％硫酸葡聚糖 2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。

(四)雜交與顯色

1．雜交 將已標記的探針加入預雜交液即成為雜交液（探針濃度為1μg/m1），切片經(jīng)2×SSC短暫浸洗后，滴加雜交液，于濕盒內置37℃或42℃孵育過夜。然后依次經(jīng)2×SSC室溫浸洗1h，l×SSC室溫浸洗lh，0.5×SSC 37℃浸洗30min，0.5×SSC室溫浸洗30分鐘。注意滴加雜交液時切片勿干燥。

2． 顯色 以下各步都要在室溫下進行。

（1）緩沖液I洗1分鐘。

（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的緩沖液I孵育切片30分鐘。

（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的緩沖液I稀釋羊抗Dig抗體。

（4）將抗體稀釋液滴加在切片上，封口膜覆蓋，濕盒內4℃孵育過夜。

（5）緩沖液I洗10分鐘。

（6）緩沖液Ⅱ洗10分鐘。

（7）加顯色液，封口膜覆蓋，避光室溫孵育2～20h，隨時鏡檢，當顯色滿意時入緩沖液Ⅲ終止顯色。

顯色液臨用前配，其配方為：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑 2.4mg；④緩沖液Ⅱ 加至10ml。

（8）常規(guī)脫水、透明、封固。

結果：雜交陽性信號為紫藍色顆粒。

(五)原位雜交對照試驗

同免疫組織化學染色對照一樣，為證明原位雜交實驗操作的準確性和實驗結果的特異性，需要設置一系列對照實驗，具體的各種對照實驗的設置及其意義請參考原位雜交專著，以下僅介紹幾種常用的對照實驗。

1． 省去標記探針 在做原位雜交時，以PBS或預雜交液替代雜交液，結果應該是陰性，這是一種簡單而有意義的陰性對照實驗。如省去標記探針仍出現(xiàn)陽性反應，這肯定是假陽性。

2． 自身對照 用同一組織切片或涂片上與靶序列無關的其他結構作對照。陽性與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。

3． 陰性對照 用已知不存在相應靶序列的組織標本雜交，結果應為陰性。陰性對照可排除在雜交過程中由于非特異性雜交反應等因素造成的假陽性結果。

4． 陽性對照 用已知含靶序列的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陽性，稱陽性對照。通過陽性對照可證明雜交過程中各個步驟以及所使用的試劑都合乎標準，實驗方法可靠。尤其當待檢標本為陰性時，陽性對照片呈陽性反應可排除待檢標本假陰性的可能。故若預期雜交結果為陰性時，就必須設陽性對照，當陽性對照亦不顯色，就證明雜交過程的某一步驟或所用試劑問題。