關(guān)鍵詞：免疫組化染色

（1）烘片：將石蠟切片放入在60 ℃烘箱中烘片至少60分鐘（烘片能提高脫蠟效果，為了省時省力也可過夜烘片，但烘片時間不能過長，否則可能損壞組織）；

（2）脫蠟：將烘好片的石蠟切片完全浸入（至少超過組織，下面也一樣）二甲苯中進行脫蠟處理：二甲苯Ⅰ 20 分鐘，二甲苯Ⅱ 20 分鐘（二甲苯脫蠟時間越長，脫蠟效果越好，二甲苯脫蠟次數(shù)越多，脫蠟效果越好；一般選擇2次二甲苯，每次20分鐘）；

（3）水化：將脫蠟好的石蠟切片依次、完全浸入不同濃度乙醇中進行水化處理：100% 乙醇 10 分鐘，100% 乙醇 10 分鐘，95% 乙醇 5 分鐘，90% 乙醇 5 分鐘，85%乙醇 5 分鐘，70% 乙醇 5 分鐘，自來水或PBS潤洗石蠟切片幾次（乙醇水化時間也可稍短，至少3分鐘；因乙醇可溶于水，自來水或PBS潤洗石蠟切片無時間要求，我們一般潤洗，就是換水5-10次）；

（4）抗原修復(fù)：在高壓鍋（可用帶氣孔的蒸飯鍋）中加入適量枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，將潤洗好的石蠟切片沒入枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中（液面沒過組織），將高壓鍋放入微波爐中加熱10 分鐘至抗原修復(fù)液煮沸，打開鍋蓋檢查有無氣泡（有氣泡表示枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液已沸騰），蓋好鍋蓋后繼續(xù)加熱5 分鐘后打開鍋蓋在室溫下自然冷卻，正常約30分鐘；

Tips：a、常用的修復(fù)方法有熱修復(fù)、微波修復(fù)及高壓修復(fù)，其抗原修復(fù)效果依次增強；b、常用的抗原修復(fù)液有枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液、EDTA修復(fù)液，這兩種抗原修復(fù)液對絕大多數(shù)抗原的修復(fù)均有相當良好的修復(fù)效果；c、對于相對較難檢測的蛋白比如核蛋白優(yōu)先選擇高壓修復(fù)，修復(fù)液最好參考抗體說明書；d、抗原修復(fù)時尤其是高壓修復(fù)，需注意把握抗原修復(fù)時間（一般根據(jù)預(yù)實驗決定修復(fù)時間），時間過長，容易導(dǎo)致組織脫片；

（5）PBS漂洗修復(fù)好的石蠟切片3次，每次5分鐘；

（6）封閉內(nèi)源性過氧化氫酶：采用3%的雙氧水完全浸沒石蠟切片，室溫下避光封閉30分鐘后，PBS漂洗石蠟切片3次，每次5 分鐘；

tips：a、如不進行過氧化氫酶的封閉，容易引起非特異性染色，即背景；b、也有研究者采用3%的雙氧水以滴加的方式封閉內(nèi)源性過氧化氫酶；c、封閉時間至少15分鐘；d、筆者習(xí)慣采用浸沒的方式封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，并回收、重復(fù)使用，最長曾使用2月；e、3% 雙氧水可用試劑公司的10%或30%的雙氧水配制，亦可用醫(yī)用雙氧水配制；f、有的研究者會在抗原修復(fù)以前進行過氧化氫的封閉，筆者采用抗原修復(fù)以后進行過氧化氫封閉，兩者簡可，個人認為過氧化氫酶的活性在抗原修復(fù)以后能達到最佳狀態(tài)，因此個人認為在抗原修復(fù)以后進行過氧化氫封閉，效果更佳。

（7）封閉內(nèi)源性抗原：采用0.1% PBST配制的5% BSA抗原封閉液，室溫封閉60 分鐘（封閉原則同Western-blotting，常用的時5-10% BSA）；

（8）一抗孵育：滴加0.1% PBS稀釋好的一抗工作液，4 ℃過夜（抗體孵育結(jié)束后可回收抗體，用于Western-Blotting，最好不要重復(fù)用于免疫組化），PBS漂洗3次，每次5 分鐘；

（9）二抗孵育：滴加適量HRP標記過的對應(yīng)種屬的二抗工作液，室溫孵育60 分鐘；

（10）信號放大：滴加適量生物素底物，室溫反應(yīng)30 分鐘后PBS漂洗3次，每次5 分鐘；

（11）DAB顯色：按照廠家的試劑使用說明配制1×DAB顯色液，滴加至甩干的石蠟組織上，反應(yīng)一段時間，顯微鏡下觀察顯色情況，及時用自來水終止染色，并用自來水潤洗石蠟切片數(shù)次；

（12）蘇木精復(fù)染：將潤洗過的石蠟切片沒入蘇木精染液中10-20s，隨后用自來水清洗蘇木精染液，（大部分研究者也采用氨水返藍：在氨水中浸潤與提出組織3-4次，和鹽水酒精分化：在鹽酸酒精中浸潤與提出石蠟切片3-4次，需注意氨水及鹽水酒精和時間，否則容易導(dǎo)致脫色，脫色后亦可DAB再次顯色，上述步驟根據(jù)蘇木精的類型決定），后采用pH為7.2-7.4的PBS浸泡石蠟切片10分鐘（PBS浸潤時間可使得細胞核的藍色和目的蛋白的棕色顏色更加鮮艷和靚麗，PBS浸泡時間越長，效果越好）；

（13）組織脫水：按下列步驟進行組織脫水， 70% 乙醇5分鐘，85%乙醇5分鐘，90% 乙醇5分鐘，95% 乙醇5分鐘，100% 乙醇10分鐘，100% 乙醇10分鐘（原理與水化類似）；

（14）石蠟透明：按以下步驟進行組織透明，二甲苯20 分鐘，二甲苯20分鐘；

（15）封片：滴加適量樹脂封片，注意不要有氣泡（待樹脂干燥以后，可用二甲苯及無水乙醇擦洗撥片，去除多余樹脂，保持撥片干凈）；

（16）掃描石蠟組織切片并進行數(shù)據(jù)分析。