一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理

應(yīng)用免疫學(xué)和組織化學(xué)原理，對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位定性、定位或定量研究，稱為免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)。

眾所周知，抗體與抗原的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組織化學(xué)就是利用這一特性，即先提取組織或細(xì)胞中的一些化學(xué)物質(zhì)，然后作為抗原或半抗原免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體。然后將此抗體(第一抗體)作為抗原免疫動(dòng)物制備第二抗體，用某種酶(常用的辣根過氧化物酶)或生物素處理，再與前述抗原成分結(jié)合，擴(kuò)增抗原。由于抗體與抗原結(jié)合形成的免疫復(fù)合物是無色的，所以需要借助組織化學(xué)方法顯示抗原與抗體的反應(yīng)部位(常見的顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒)。

通過抗原抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，可以顯示細(xì)胞或組織內(nèi)的化學(xué)成分，在顯微鏡下可以清楚地看到細(xì)胞內(nèi)抗原抗體反應(yīng)的產(chǎn)物，從而可以原位確定某些化學(xué)成分在細(xì)胞或組織內(nèi)的分布和含量?；蛘呓M織中任何可以作為抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸、病原體等，都可以通過相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。

二、免疫組織化學(xué)染色法

1.根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等?？煞譃?a href="http://bjzjay.cn/" target="_self">免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)記法和免疫金銀法等。

2.按染色步驟可分為直接法(也稱一步法)和間接法(二步法、三步法或多步法)；與直接法相比，間接法的靈敏度要高得多。

3.根據(jù)結(jié)合方法可分為抗原抗體結(jié)合法，如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接法，如卵清蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法和鏈霉菌親和素-過氧化物酶連接(SP)法，其中SP法是最常用的方法。

三、幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理

1.免疫熒光法

這是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)?；诳乖贵w特異性結(jié)合的原理，將已知的抗體用熒光素標(biāo)記，作為探針檢查細(xì)胞或組織中相應(yīng)的抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受到激發(fā)光照射時(shí)，會發(fā)出一定波長的熒光，從而可以確定抗原在組織中的位置，進(jìn)而進(jìn)行定量分析。免疫熒光技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便而廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷和檢驗(yàn)。

2.免疫酶標(biāo)記法

免疫標(biāo)記是20世紀(jì)60年代繼免疫熒光之后發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)?；驹硎窍葘⒚笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞反應(yīng)，再加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒。通過光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡，定位細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的各種抗原成分。免疫標(biāo)記技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。

和免疫熒光技術(shù)相比，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):定位準(zhǔn)確，對比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適用于光鏡和電鏡研究。

隨著酶標(biāo)記方法的快速發(fā)展，衍生出了多種標(biāo)記方法。隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度也在不斷提高，使用也越來越方便。目前病理診斷中廣泛應(yīng)用的有PAP法、ABC法和SP法。

3.免疫膠體金技術(shù)

膠體金技術(shù)使用膠體金，一種特殊的金屬顆粒，作為標(biāo)記。金膠體是指金的水溶膠，能快速穩(wěn)定地吸附蛋白質(zhì)，但對蛋白質(zhì)的生物活性無明顯影響。因此，利用膠體金標(biāo)記的一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白(如葡萄球菌蛋白A)的分子作為探針，可以對組織或細(xì)胞中的抗原進(jìn)行定性、局部甚至定量的研究。由于膠體金具有大小不一的顆粒，且膠體金的電子密度高，因此免疫膠體金技術(shù)特別適用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。膠體金本身是淺到暗紅色的，所以也適合光學(xué)顯微鏡觀察。比如應(yīng)用銀增強(qiáng)免疫金銀法則，用光學(xué)顯微鏡觀察更方便。

四、免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢

1.特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定了抗原和抗體的結(jié)合具有高度的特異性。所以從理論上講，免疫組化也是抗原在組織細(xì)胞中的特異性展示，比如角蛋白展示上皮成分，LCA展示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.高靈敏度在免疫組化應(yīng)用的初期，由于技術(shù)的限制，只有直接法和間接法等低靈敏度的技術(shù)。這時(shí)候抗體只能稀釋幾倍或者幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，稀釋幾千、幾萬甚至幾億倍的抗體仍能在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合。這種高度敏感的抗體-抗原反應(yīng)使得免疫組織化學(xué)方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷。

3.定位準(zhǔn)確，形態(tài)與功能相結(jié)合。該技術(shù)可以通過抗原抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)在組織和細(xì)胞中準(zhǔn)確定位抗原，使不同的抗原在同一組織或細(xì)胞中同時(shí)定位和觀察，從而研究形態(tài)和功能的結(jié)合，對病理學(xué)的進(jìn)一步研究具有重要意義。